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手把手教你做组织免疫荧光染色

小师妹最近在学做小鼠脑组织免疫荧光,图片一塌糊涂,不是背景过强就是染不上荧光,越做越沮丧,感觉世界背叛了她。还好她有一个我这么外貌与智慧并存的师兄,手把手传教。看完你要不要skr一下?

手把手教你做组织免疫荧光染色

 

万丈高楼拔地起,关键在于基础打的好,所以组织免疫荧光实验前组织样品制备极其重要。组织样品(脑、肾、心脏和其他器官)最好是经过心脏灌流固定,使细胞内的各种物质尽可能保持在其生活状态时的形态结构和位置;另外,组织固定后,具有硬化作用,增加了组织的韧性,有利于取材和组织脱水,如果样本没有及时固定或固定不恰当,导致自溶或腐败,将无法逆转。

 

 

一、心脏灌流

 

 

1、将麻醉后的小鼠仰面朝上固定四肢。V字形剪开腹部,剪至胸膜处,打开胸腔,暴露出心脏。

 

2、从小鼠左心室尖将针头(钝化处理)插入左心室,用剪刀剪破右心耳,使血液流出,将针头插至主动脉,止血钳固定针头。快速灌注0.9%生理盐水,至无血液排出,四肢、肝脏变白为止,时间维持在5 min左右。

 

手把手教你做组织免疫荧光染色

小鼠灌流示意图(摘自网络)

 

3、更换装有冰冷4% 多聚甲醛(PFA)的针管,灌流固定。开始阶段会出现尾巴向腹部翘起、四肢肌肉颤抖现象,此时降低灌注速度,以使固定充分。至肝脏、四肢变硬为止,灌注60 ml左右,时间维持在10 min左右。

 

4、取组织器官置于冰冷的4% PFA中,24 h后,将组织转移至30%的蔗糖溶液中,脱水3 d以上。脱水完全时,组织会沉入底部,可两天更换一次蔗糖水。

 

以上步骤可以保证组织充分固定。另PFA有毒,需做好防护

 

手把手教你做组织免疫荧光染色

 

然后进行切片和荧光染色。切片要保证均匀、完整、损伤低。荧光染色是本实验的关键,选择合适抗体,操作要轻柔,以防止机械损伤。正式实验前,建议进行预实验,以确定最佳抗体浓度。

 

二、免疫荧光染色

 

1、切片。一定要保证样品充分固定和脱水后再切片。用冷冻切片机冠状切片,厚度为20-30 μm。收集在0.01M PBS中,4℃保存。也可放入冻存液中,-20℃中可长期保存。

 

 

2、挑片。挑选所需组织切片,注意要选取完整,位置准确的切片,同时避免在挑选时损伤切片。置于PBS中,摇床上漂洗3次,5 min/次。可使用24孔板进行漂洗,方便快捷。

 

3、封闭。将组织切片置于封闭液0.01 M PBS,0.3% Triton X-100,3%山羊血清,原则上尽量选择与二抗种属同源的血清,切记不可使用与组织源相同的血清中,室温、摇床慢摇、通透、封闭1 h。

 

4、一抗孵育。所有一抗使用10%山羊血清稀释。稀释比例根据抗体效价、组织蛋白表达情况决定一抗4℃孵育过夜。将组织切片置于PBS中,摇床上漂洗4次,10 min/次,洗掉非特异结合的抗体。

 

5、二抗孵育。加入二抗(1:1000 PBS稀释,我们通常使用的是Invitrogen的荧光二抗),室温、避光、摇床孵育2 h。注意二抗浓度的使用,避免浓度过高将组织切片置于PBS中,避光摇床上漂洗3次,10 min/次。

 

6、贴片。防淬灭封片剂封片,避光风干,共聚焦显微镜观察、拍片记录、结果分析。共聚焦显微镜的使用也是尤为重要的,一定要在使用前熟练掌握技术,再进行实验以免最后捕捉不到最佳图片,前功尽弃。

 

按照以上步骤和注意事项,注意细节,这样你就可以做出漂亮的免疫荧光图片啦。加油哦,先把预实验做起来!

 

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