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细胞污染的常见原因以及解决办法

细胞间总是有很多未解之谜。比如说同一个孵箱里的细胞,为什么别人的没死,我的却一直死?同一个孵箱里的同一种细胞,为什么别人养不死,我一碰就死?同一个孵箱里的细胞,为什么别人操作粗枝大叶,我操作小心翼翼,但还是养不活?今天,我带你走进细胞间未解之谜—我和细胞的水逆什么时候能结束?

 

首先贴出来两张实验室师妹培养的A549的镜下照片。这是A549复苏24小时后之后的样子,复苏12小时之后曾拿出孵箱镜下观察细胞状态,那时候的细胞基本上80%已经贴壁,本准备24小时后换液处理。

 

但是24小时之后再观察细胞状态,就变成下面的样子了,所有贴壁细胞都聚团漂浮起来,而且培养皿背景下还有很多细小的砂砾状黑色颗粒,是无法用PBS洗掉的那种。很明显这是细胞污染的表现。

 

 

一般情况下,如果你的细胞被细菌污染了,培养皿或瓶中的细胞状态很快就会发生变化,表现为胞浆中出现大量的颗粒,液体浑浊、培养基PH下降,变成黄色,贴壁细胞形态变圆、会脱壁死亡;而受到真菌污染的细胞,细胞状态并不会马上发生变化,培养3-4天后,你可能才会在培养皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小点儿。所以很明显,这个A549是被细菌污染了。

 

但很奇怪的是,实验室里养这个细胞的并不是只有师妹一个人,其他人养的A549都坚挺的活着,而她的A549不管是复苏、传代亦或是从别人那里刚借来的细胞都死翘翘了,搞得她有一个月的时间不敢养任何细胞,所以整个实验室的人都在帮她找污染的原因。

 

首先,我们使用的都是同一种血清、双抗和培养基,如果是上述哪一种出现问题,那么应该是所有的人细胞都出问题了才对,排除!其次,她每次使用前都会把需要使用的器材放在超净台中紫外照射30分钟以上,所以也不会是使用器材造成的污染,排除!最后我们把目光集中到了细胞间水浴箱和服装穿戴上。因为最近除了师妹以外,其他人都没有复苏细胞。而师妹为了方便,将水浴箱搬到了紫外照射区域外,水浴箱里的水就是水龙头里的自来水,而且还飘着只死蛾子…..而这位师妹自从进了细胞间以后,就没有洗过白大衣,也没有更换过手套。即使细胞间的白大衣常年被紫外照着,但也是要定期清洗的。

 

所以啊,虽然不敢说这一定是造成细胞污染的原因,但是这样的日常操作,细胞不死都怪了。细胞培养过程中,无论是配制试剂还是水浴锅中用于细胞复苏的水,都需要使用超纯水;并且,即使冻存管是使用封口膜封存的,也要在超纯水中复苏才可以。

 

与此同时,人员流动也是细胞间无法控制的污染原因之一。人员流动本身就会携带很多灰尘,而细菌就会附集在灰尘之中,细胞间的无菌服除了需要定期清洗更换外,在穿着上也有要求。如下图所示,正规穿法是将白大衣的袖口掖到手套里,皮肤、头发或者女生佩戴的饰品都不可以暴露在超净台下。所以如果你不爱洗澡,也请你离细胞间远一点。

 

那么遇到细菌污染的情况下,我们该怎么处理?

 

如果污染较小,可以把庆大霉素、万古霉素或氨卡青霉素加入培养液中,具体的使用量按照说明书配制就可以了,24小时后换液。如果上述这些药物不方便购买,也可以去药店购买这种左氧氟沙星的注射液。刚发现细胞污染的时候,可以在6cm培养皿中加入500ul左氧氟沙星的注射液,每隔24小时换一次液,之后依次是300ul、100ul,基本上3-4天后就可以改善污染情况。但是上述的做法多多少少都会损伤细胞,所以如果细胞存量还有很多,建议发现污染就直接扔掉

 

下面这张图拍摄的是20倍镜下肺微血管内皮细胞的状态。图中大致可看到内皮细胞开始出现老化的状态,而我用红色圈出的地方,镜下可见细胞质中有多个空泡(拍摄的效果不是很清晰)。有人说,内皮细胞是一种“很脏”的细胞,因为在培养过程中细胞之间的挤压和叠加,视觉下会看到很多圆形结构。这种情况不一样,细胞质和细胞核中出现很多空泡,这是很明显的异常显现,但即便如此培养基的颜色并没有发生变化,细胞仍在继续分裂生长,只是形态发生老化而已。

 

 

这种情况基本上可以判定是支原体污染了。细胞受到支原体污染后比真菌污染更难发现。最开始的阶段,细胞不会发生任何变化,培养基的颜色和细胞状态都不会有任何差别。当你传代几次之后,你会发现细胞生长速度缓慢,形态开始老化。如果不仔细观察细胞内部的变化,我们很容易将其归结于由于个人处理不当导致的细胞老化。这也提醒我们一点,日常观察细胞状态如何,不只是看有没有细胞死亡这么简单。

 

支原体污染后的细胞,高倍镜下可见细胞核或胞浆内会出现大小不等的空泡,细胞经常表现出一种突然暴毙的状况,而我们也很难找到具体是在哪一阶段感染了支原体。所以即使在这期间冻存细胞,再次复苏后,仍会有支原体污染的情况存在。

支原体污染影响的不仅是细胞形态和生长速度,也会改变细胞的自身的特性,诱导染色体发生改变,所以即使细胞没有死,也一样会对实验结果产生影响。

 

目前很多试剂公司都有针对支原体污染的抑制剂,但是价格都不便宜。支原体污染和细菌或真菌污染还有所不同,一旦发现支原体污染,很可能是一个孵箱或一个实验室的整体问题,而不是个人情况。所以为了预防支原体污染和扩散,最好的办法就是一经发现马上扔掉以及定期清理消毒细胞间。

 

还没有经历过真菌污染的情况,所以不能为大家分享这方面的处理方法。但是除了上述说的两种问题,还有一种是细胞间的不可抗力—有些人某一时间段养什么细胞都会死,排查了所有可疑点,都找不到污染原因。遇到这样的情况,我们只能让他冷静冷静,远离细胞间一段时间,然后就好了。

 

So,你和你的细胞经历过水逆吗?

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